Avaliação fenotípica e funcional de células dendríticas inflamatórias na dermatite atópica do adulto

Introdução: A dermatite atópica (DA) é uma enfermidade cutânea inflamatória de caráter crônico, na qual o prurido é constante, e com marcada xerose. Dermatose que geralmente se inicia na infância, e pode surgir em indivíduos com história pessoal ou familiar de asma, rinite alérgica e/ou DA. A pele com DA apresenta colonização por Staphylococcus aureus (S. aureus) em 80-100% dos casos, sendo responsável pela produção enterotoxinas, capazes de exacerbar a resposta inflamatória na DA. Nesta enfermidade, existem distintos subtipos de células apresentadoras de antígeno ou dendríticas (DC), tanto na pele quanto circulantes. As DC exercem papel relevante na inflamação da DA, em especial um subgrupo de células dendríticas mieloides (mDC), as chamadas células dendríticas inflamatórias epidérmicas (IDEC). Objetivo: Avaliar o fenótipo e a função das mDC (IDEC-like) em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) na DA do adulto. Métodos: Foram selecionados 21 pacientes com DA (idades entre18 e 65 anos, sendo 13 homens e oito mulheres) e 21 controles (idades entre 21 e 41 anos, sendo oito homens e 13 mulheres), nos quais foram realizadas as avaliações fenotípica e funcional das mDC (IDEC-like) em PBMC. Para tal, foram analisadas as expressões de: Fc?RI, TNF, IFN-y, IL-10, CD36 e CD83 nas mDC, estimuladas com enterotoxina estafilocócica B (SEB), agonistas de TLR2 (Pam3CSK4), TLR4 (LPS) e de TLR7/8 (CL097) através da citometria de fluxo. Resultados: Os principais achados nos pacientes com DA foram: aumento da frequência de células IDEC-like frente ao estímulo com agonista de TLR2 (Pam3CSK4); aumento da frequência de IFN-y em condição não estimulada, e de IL-10 frente a estímulo com agonista de TLR7/8 (CL097) nesta população de células dendríticas. Conclusão: A caracterização das mDC circulantes na DA evidencia perfil pró-inflamatório em condição não estimulada, impactando na resposta imune adaptativa. O aumento significativo na frequência de células IDEC-like nos pacientes com DA sugere sua participação na perpetuação do processo inflamatório da DA

Emprego do ultra-som modo B e com efeito Doppler, termômetro infravermelho e medidas antropométricas na avaliação de uma formulação cosmética anticelulítica contendo extrato hidroglicólico de Trichilia catigua e Ptychopetalum olacoides Bentham

Hidrolipodistrofia ginóide (H.L.D.G.), a celulite, é comumente tratada com cosméticos contendo extratos vegetais. O estudo realizado foi: ultra-sonografia na avaliação da espessura da hipoderme e a microcirculação cutânea; uso de termômetro infravermelho na medida da temperatura e análise das medidas antropométricas da uma formulação cosmética anticelulítica contendo extrato hidroglicólico de Trichilia catigua e Ptychopetalum olacoides Bentham (catuaba e marapuama). Foram realizadas medidas iniciais e após aplicação da formulação. Os resultados apresentaram alterações estatisticamente significativas para a temperatura cutânea e medidas antropométricas. Não houve diferenças estatisticamente significativas nas medidas da hipoderme e microcirculação. Considerando os resultados, a formulação avaliada possui potencial ação coadjuvante na redução da hidrolipodistrofia ginóide. As técnicas podem ser associadas em conjunto com a avaliação sensorial e apreciabilidade cosmética. Os requisitos chaves para a reprodutibilidade das técnicas incluem ambiente controlado, monitoramento e climatização dos voluntários, procedimentos de medidas padronizados, protocolos de aplicação realístico e operadores qualificados.

Desenvolvimento de uma plataforma modelo para a busca de ligantes com potencial leishmanicida baseado na inibição seletiva da enzima diidroorotato desidrogenase

As doenças tropicais negligenciadas (DTNs) causam um imenso sofrimento para a pessoa acometida e em muitos casos podem levar o indivíduo a morte. Elas representam um obstáculo devastador para a saúde e continuam a ser um sério impedimento para a redução da pobreza e desenvolvimento socioeconômico. Das 17 doenças desse grupo, a leishmaniose, incluindo a leishmaniose cutânea, tem grande destaque devido sua alta incidência, os gastos para o tratamento e as complicações geradas em processos de coinfecção. Ainda mais agravante, os investimentos direcionados ao controle, combate e principalmente a inovação em novos produtos é ainda muito limitado. Atualmente, a academia tem um importante papel na luta contra essas doenças através da busca de novos alvos terapêuticos e também de novas moléculas com potencial terapêutico. É nesse contexto que esse projeto teve como meta a implantação de uma plataforma para a identificação de moléculas com atividade leishmanicida. Como alvo terapêutico, optamos pela utilização da enzima diidroorotato desidrogenase de Leishmania Viannia braziliensis (LbDHODH), enzima de extrema importância na síntese de novo de nucleotídeos de pirimidina, cuja principal função é converter o diidroorotato em orotato. Esta enzima foi clonada, expressa e purificada com sucesso em nosso laboratório. Os estudos permitiram que a enzima fosse caracterizada cineticamente e estruturalmente via cristalografia de raios- X. Os primeiros ensaios inibitórios foram realizados com o orotato, produto da catálise e inibidor natural da enzima. O potencial inibitório do orotato foi mensurado através da estimativa do IC50 e a interação proteína-ligante foi caracterizada através de estudos cristalográficos. Estratégias in silico e in vitro foram utilizadas na busca de ligantes, através das quais foram identificados inibidores para a enzima LbDHODH. Ensaios de validação cruzada, utilizando a enzima homóloga humana, permitiram identificar os ligantes com maior índice de seletividade que tiveram seu potencial leishmanicida avaliado in vitro contra as formas promastigota e amastigota de Leishmania braziliensis. A realização do presente projeto permitiu a identificação de uma classe de ligantes que apresentam atividade seletiva contra LbDHODH e que será utilizada no planejamento de futuras gerações de moléculas com atividade terapêutica para o tratamento da leishmaniose. Além disso, a plataforma de ensaios otimizada permitirá a avaliação de novos grupos de moléculas como uma importante estratégia na busca por novos tratamentos contra a leishmaniose

Padronização e validação de marcadores moleculares para o diagnóstico da Leishmaniose Tegumentar

O diagnóstico da leishmaniose tegumentar (LT) baseia-se em critérios clínicos e epidemiológicos podendo ser confirmado por exames laboratoriais de rotina como a pesquisa direta do parasito por microscopia e a intradermorreação de Montenegro. Atualmente, os métodos moleculares, principalmente a reação da cadeia da polimerase (PCR), têm sido considerados para aplicação em amostras clínicas, devido a sua alta sensibilidade e especificidade. Este trabalho teve como objetivo a padronização e validação das técnicas de PCR-RFLP com diferentes iniciadores (kDNA, its1, hsp70 e prp1), visando o diagnóstico e a identificação das espécies de Leishmania presentes em amostras de DNA provenientes de lesões de pele ou mucosa de 140 pacientes com suspeita de leishmaniose tegumentar. Para tal, realizamos ensaios de: 1) sensibilidade das PCRs com os diferentes iniciadores, 2) especificidade dos ensaios utilizando DNAs de diferentes espécies de referência de Leishmania, de tripanossomatídeos inferiores e de fungos, 3) validação das técnicas de PCR-RFLP com os iniciadores estudados em amostras de DNA de lesões de pele ou mucosas de pacientes com LT. Os resultados dos ensaios de limiar de detecção das PCR (sensibilidade) mostraram que os quatro iniciadores do estudo foram capazes de detectar o DNA do parasito, porém em quantidades distintas: até 500 fg com os iniciadores para kDNA e its1, até 400 fg com hsp70 e até 5 ng com prp1. Quanto à especificidade dos iniciadores, não houve amplificação dos DNAs fúngicos. Por outro lado, nos ensaios com os iniciadores para kDNA e hsp70, verificamos amplificação do fragmento esperado em amostras de DNA de tripanossomatídeos. Nos ensaios com its1 e prp1, o padrão de amplificação com os DNAs de tripanossomatídeos foi diferente do apresentado pelas espécies de Leishmania. Verificou-se nos ensaios de validação que o PCR-kDNA detectou o parasito em todas as 140 amostras de DNA de pacientes e, assim, foi utilizado como critério de inclusão das amostras. A PCR-its1 apresentou menor sensibilidade, mesmo após a reamplificação com o mesmo iniciador (85,7% ou 120/140 amostras). Para os ensaios da PCR-hsp70, as amostras de DNA foram amplificadas com Repli G, para obter uma sensibilidade de 68,4% (89/140 amostras). A PCR-prp1 não detectou o parasito em amostras de DNA dos pacientes. Quanto aos ensaios para a identificação da espécie presente na lesão, a PCR-kDNA-RFLP-HaeIII e a PCR-its1- RFLP-HaeIII permitem a distinção de L. (L.) amazonensis das outras espécies pertencentes ao subgênero Viannia. A PCR-hsp70-RFLP-HaeIII-BstUI, apesar de potencialmente ser capaz de identificar as seis espécies de Leishmania analisadas, quando utilizada na avaliação das amostras humanas permitiu apenas a identificação de L. (V.) braziliensis. No entanto, é uma técnica com várias etapas e de difícil execução, o que pode inviabilizar o seu uso rotineiro em centros de referência em diagnósticos. Assim, recomendamos o uso dessa metodologia apenas em locais onde várias espécies de Leishmania sejam endêmicas. Finalmente, os resultados indicam que o kDNA-PCR devido à alta sensibilidade apresentada e facilidade de execução pode ser empregada como exame de rotina nos centros de referência, permitindo a confirmação ou exclusão da LT.